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- 品牌：瑞清
- 產(chǎn)地：深圳
- 貨號(hào)：RQ-XG12121
- 發(fā)布日期： 2023-02-20
- 更新日期： 2024-11-20
| 產(chǎn)地 | 深圳 |
| 品牌 | 瑞清 |
| 貨號(hào) | RQ-XG12121 |
| 保存條件 | 詳見說明書 |
| 用途 | 科研實(shí)驗(yàn) |
| 包裝規(guī)格 | 5×105 |
| 保質(zhì)期 | 詳見說明書 |
| 是否進(jìn)口 | 否 |
細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1) 培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備:
1. 準(zhǔn)備 McCOY's 5A 培養(yǎng)基(McCOY's 5A,SIGMA,貨號(hào) M4892,添加 NaHC03 2.2g/L),90%;you質(zhì)胎牛血清,10%。
2. 培養(yǎng)條件:氣相:空氣,95%;碳,5%。溫度:37攝氏度,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3. 凍存液:90%完全培養(yǎng)基,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。
2) 細(xì)胞處理:
復(fù)蘇細(xì)胞:將含有 lmL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37°C 水浴中迅速搖晃解凍,加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均勻。在 1000RPM 條件下離心 4分鐘,棄去上清液,補(bǔ) 加 l-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或?qū)?細(xì)胞懸液加入 l〇cm皿中,加入約 8ml 培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜)。隔天換液并檢查細(xì)胞密度。
細(xì)胞凍存:
待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí),可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí),先要消化處理并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。消化方法按照細(xì)胞傳代方法步驟進(jìn)行, 重懸液使用血清。懸浮細(xì)胞直接計(jì)數(shù)后離心,用血清重懸浮,加 DMSO 至最終濃度為10%。加入 DMSO 后迅速混勻,按每 lml 的數(shù)量分配到凍存管中。本公司按每個(gè)凍存管細(xì)胞數(shù)目大于 1X106個(gè)細(xì)胞凍存。
細(xì)胞接受后的處理:
1. 收到細(xì)胞后,請檢查是否漏液,如果漏液,請拍照片發(fā)給我們。
2. 請先在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞生長狀態(tài),去掉封口膜并將 T25瓶置于 37°C 培養(yǎng)約 2-3h〇
3. 棄去 T25瓶中的培養(yǎng)基,添加 6ml 本公司附帶的完全培養(yǎng)基。
4. 如果細(xì)胞長滿(90%以上)請及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代,傳代培養(yǎng)用 6ml 本公司附帶的完全培養(yǎng)基。
5. 接到細(xì)胞次日,請檢查細(xì)胞是否污染,若發(fā)現(xiàn)污染或疑似污染,請及時(shí)與我們?nèi)〉寐?lián)系。
培養(yǎng)方法:
收到細(xì)胞后,在倒置顯微鏡下觀察整個(gè)細(xì)胞生長情況:
如果細(xì)胞未長滿,用75%酒精噴灑整個(gè)瓶消毒后放到超菌臺(tái)內(nèi),嚴(yán)格無菌操作,打開細(xì)胞培養(yǎng)瓶,留10ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
如果細(xì)胞已長滿(達(dá)80-90%)。即可進(jìn)行傳代,具體步驟如下:
a,棄去培養(yǎng)液,用PBS洗1-2次。
b,向瓶內(nèi)加入1.0-2.0ml酶液,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況,若細(xì)胞大部分變圓,迅速拿回操作臺(tái),吸取酶,加含有6ml 含10%血清的培養(yǎng)液,輕輕吹打細(xì)胞。
c,加入等量的的培養(yǎng)液,輕輕吹打混勻后吸出一半,分到新的培養(yǎng)
d,傳代比例:1:2-1:3
對于懸浮細(xì)胞,傳代可參考以下方法:
方法一:收集細(xì)胞,1000RPM,常溫條件下離心 5分鐘,棄去上清液,補(bǔ)加 l-2mL 培養(yǎng)液后吹句,將細(xì)胞懸液按 1: 2到 1: 5的比例分到新的含 8ml 培 養(yǎng)基的 新皿中或者瓶中。
方法二:可選擇半數(shù)換液方式,棄去半數(shù)培養(yǎng)基后,將剩余細(xì)胞懸起,將細(xì) 胞懸 液按 1: 2到 1: 3的比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
操作要點(diǎn):
1)將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱;準(zhǔn)備一個(gè)15mL無菌的離心管,加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。
2)將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出,快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫(可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯,裝滿37℃的水,細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi),再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中)。輕輕晃動(dòng)凍存管,使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)完全解凍,使細(xì)胞能盡快通過易受損的溫度段(-5~0℃)。注意凍存管管口不能沒入水中,避免引起污染。
3)用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi),將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi),輕輕吹打液體,使細(xì)胞均勻分散,吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次,均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。
4)800rpm離心5min,棄上清,加入新鮮的培養(yǎng)基,吹打制成細(xì)胞懸液。
5)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶內(nèi),補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基,輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻,放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。
6)隔天觀察細(xì)胞貼壁生長情況,換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞長至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過2~3次傳代,細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
友情提示注意以下幾點(diǎn):
1、收到細(xì)胞后請盡快更換為含15%血清的新鮮培養(yǎng)基,如因特殊情況需要繼續(xù)使用原瓶,請?jiān)谠颗囵B(yǎng)基中額外添加10%的血清
2、貼壁細(xì)胞收到當(dāng)天切忌立刻消化,請將細(xì)胞換液后放置培養(yǎng)箱孵育到隔天再做消化傳代,請優(yōu)先選擇直徑6cm的培養(yǎng)皿進(jìn)行傳代培養(yǎng)
3、如簽收時(shí)出現(xiàn)培養(yǎng)瓶壁破裂,漏液等情況請及時(shí)做好照片記錄并聯(lián)系實(shí)驗(yàn)室
細(xì)胞用途:僅供科研使用。
